TIANSeq NGS စာကြည့်တိုက် Amplification Module

လက်ရှိတွင် high-throughput sequencing နည်းပညာသည်အဓိကအားဖြင့်နောက်မျိုးဆက် sequencing နည်းပညာကိုအခြေခံသည်။ နောက်မျိုးဆက် sequencing နည်းပညာ၏စာဖတ်အရှည်သည်အကန့်အသတ်ရှိသောကြောင့်ကျွန်ုပ်တို့သည်အပိုင်းအစုံကိုစာကြည့်တိုက်ငယ်များသို့အပိုင်းလိုက်ခွဲရမည်။ ကွဲပြားသော sequencing စမ်းသပ်မှုများ၏လိုအပ်ချက်များအရကျွန်ုပ်တို့သည်များသောအားဖြင့် single-ended sequencing သို့မဟုတ် double-ended sequencing ကိုရွေးချယ်လေ့ရှိသည်။ လောလောဆယ်မျိုးဆက်သစ်စာကြည့်တိုက်၏ DNA အပိုင်းအစများကိုယေဘူယျအားဖြင့် ၂၀၀ မှ ၈၀၀ bp အတွင်းဖြန့်ဝေသည်။

a) DNA သည်အရည်အသွေးညံ့ဖျင်းပြီး inhibitors များပါ ၀ င်သည်။ အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်မှုကိုဟန့်တားရန်အရည်အသွေးမြင့် DNA နမူနာများကိုသုံးပါ။

b) DNA စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရန် PCR-free နည်းလမ်းကိုသုံးသောအခါ DNA နမူနာပမာဏမလုံလောက်ပါ။ အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသော DNA ၏ထည့်သွင်းမှုသည် ၅၀ ng ထက်ကျော်လွန်ပါကစာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရေးလုပ်ငန်းစဉ်အတွင်း PCR- အခမဲ့လုပ်ငန်းစဉ်ကိုရွေးချယ်နိုင်သည်။ စာကြည့်တိုက်၏မိတ္တူအရေအတွက်သည်တိုက်ရိုက်စီစဉ်ရန်အလွန်နည်းလျှင် DNA စာကြည့်တိုက်ကို adapter ligation ပြီးနောက် PCR ဖြင့်ချဲ့နိုင်သည်။

ဂ) RNA ညစ်ညမ်းမှုသည်မတိကျသောကန ဦး DNA တွက်ချက်မှုကို ဦး တည်စေပြီး RNA ညစ်ညမ်းမှုသည် genomic DNA သန့်စင်မှုဖြစ်စဉ်တွင်တည်ရှိနိုင်ပြီး၎င်းသည်မတိကျသော DNA အရေအတွက်နှင့်စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်မှုအတွင်းလုံလောက်သော DNA တင်ခြင်းကို ဦး တည်စေနိုင်သည်။ RNA ကိုကုသခြင်းဖြင့် RNA ကိုဖယ်ရှားနိုင်သည်။

ဖြေ-၁

a) အသေးစားအပိုင်းအစများ (60 bp-120 bp) သေးငယ်သည့်အပိုင်းအစများသည်အများအားဖြင့် adapter များဖြင့်ဖွဲ့စည်းထားသောအပိုင်းအစများသို့မဟုတ် dimers များဖြစ်သည်။ Agencourt AMPure XP သံလိုက်ပုတီးဖြင့်သန့်စင်ခြင်းသည်ဤ adapter အပိုင်းအစများကိုထိရောက်စွာဖယ်ရှားနိုင်ပြီး sequencing အရည်အသွေးကိုသေချာစေနိုင်သည်။

b) PCR ချဲ့ထွင်မှုအပြီးတွင်စာကြည့်တိုက်၌ကြီးမားသောအပိုင်းအစများပေါ်လာပြီးစာကြည့်တိုက် DNA အပိုင်းအစ၏အရွယ်အစားသည် adapter နှင့်ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် ၁၂၀ bp အထိမြင့်တက်လာလိမ့်မည်။ DNA အပိုင်းအစသည် adapter ligation ပြီးနောက် bp ၁၂၀ ကျော်တိုးလာလျှင်၎င်းသည်အလွန်အကျွံ PCR amplification ကိုပုံမှန်မဟုတ်သောအပိုင်းအစချဲ့ခြင်းကြောင့်ဖြစ်နိုင်သည်။ PCR စက်ဝန်းအရေအတွက်လျှော့ချခြင်းသည်အခြေအနေကိုကာကွယ်နိုင်သည်။

ဂ) adapter ligation ပြီးနောက်စာကြည့်တိုက် DNA အပိုင်းအစများ၏ပုံမှန်မဟုတ်သောအရွယ်အစားဒီ kit ရှိ adapter ၏အရှည်သည် ၆၀ bp ဖြစ်သည်။ အပိုင်းအစ၏အစွန်းနှစ်ဖက်ကို adapters များနှင့်ချိတ်သောအခါအရှည်သည် ၁၂၀ bp သာတိုးလိမ့်မည်။ ဤကိရိယာမှပေးသောအခြား adapter တစ်ခုကိုသုံးသောအခါ adapter အရှည်ကဲ့သို့သက်ဆိုင်ရာအချက်အလက်များပေးရန်အတွက်ပေးသွင်းသူအားဆက်သွယ်ပါ။ ကျေးဇူးပြု၍ လက်တွေ့စမ်းသပ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်နှင့်လုပ်ဆောင်ချက်ကိုလက်စွဲတွင်ဖော်ပြထားသည့်အဆင့်များအတိုင်းလုပ်ဆောင်ပါ။

)) ပုံမှန်မဟုတ်သော DNA အပိုင်းအစအရွယ်အစားသည် adapter ligation မတိုင်မီဤပြသနာ၏အကြောင်းရင်းသည် DNA အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်စဉ်တွင်မှားယွင်းသောတုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကြောင့်ဖြစ်နိုင်သည်။ မတူညီသော DNA ထည့်သွင်းမှုအတွက်ကွဲပြားသောတုံ့ပြန်မှုအချိန်ကိုသုံးသင့်သည်။ DNA ထည့်သွင်းမှုသည် ၁၀ ng ထက်ပိုပါက ၁၂ မိနစ်တုံ့ပြန်မှုအချိန်ကိုအကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်စရန်အချိန်ကိုရွေးချယ်ရန်ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုသည်၊ ဤအချိန်တွင်ထုတ်လုပ်သောအပိုင်းအစသည်အဓိကအားဖြင့် ၃၀၀ မှ ၅၀၀ bp အတွင်းရှိသည်။ အသုံးပြုသူများသည်လိုအပ်သောအရွယ်အစားနှင့် DNA အပိုင်းအစများကိုပိုမိုကောင်းမွန်စေရန်၎င်းတို့၏ကိုယ်ပိုင်လိုအပ်ချက်များအရ ၂-၄ မိနစ်ကြာအောင် (သို့) လျှော့ချနိုင်သည်။

A-2

a) Fragmentation time ကို optimized မလုပ်ပါ၊ အပိုင်းအစများရဲ့ DNA သည်အလွန်သေးငယ်သည် (သို့) ကြီးလွန်းလျှင် ကျေးဇူးပြု၍ တုံ့ပြန်မှုအချိန်ကိုဆုံးဖြတ်ရန်ညွှန်ကြားချက်တွင်ပေးထားသော Fragmentation Time Selection အတွက်လမ်းညွှန်ချက်များကိုကိုးကားပါ။ အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်နေချိန်ကိုပိုမိုတိကျစွာချိန်ညှိရန် ၃ မိနစ်ကြာအောင်သို့မဟုတ်တိုစေရန်တုံ့ပြန်မှုစနစ်

A-3

အကွဲကွဲအပြားပြားကုသမှုပြီးနောက် DNA ၏ပုံမှန်မဟုတ်သောအရွယ်အစားဖြန့်ဖြူးခြင်း

(က) အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်စေသော reagent ၏မှားယွင်းသောအရည်ပျော်မှု (သို့) reagent သည်ပျော်ဝင်ပြီးနောက်လုံးဝရောနှောမသွားပါ။ 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagent ကိုရေခဲတွင်ထားပါ။ အရည်ပျော်သွားလျှင်ပြွန်၏အောက်ခြေကိုညင်သာစွာပွတ်တိုက်ခြင်းဖြင့်ဆေးရည်ကိုအညီအမျှရောမွှေပါ။ reagent ကိုရေမလောင်းပါနဲ့။

ခ) DNA ထည့်သွင်းသည့်နမူနာတွင် EDTA (သို့) အခြားညစ်ညမ်းမှုများပါ ၀ င်သည်၊ DNA အသန့်စင်ခြေလှမ်းတွင်ဆားအိုင်းယွန်းများနှင့် chelating အေးဂျင့်များပါ ၀ င်သည်။ DNA ကို 1 × TE တွင်ဖျက်သိမ်းလျှင်အကွဲကွဲအပြားပြားလုပ်ဆောင်ရန်ညွှန်ကြားချက်တွင်ပါရှိသောနည်းလမ်းကိုသုံးပါ။ အဖြေ၌ EDTA အာရုံစူးစိုက်မှုမသေချာလျှင်၎င်းအား DNA ကိုသန့်စင်စေပြီးနောက်ဆက်တွဲတုံ့ပြန်မှုအတွက် deionized ရေ၌ပျော်ရန်အကြံပြုသည်။

ဂ) မတိကျသောကန ဦး DNA အရေအတွက်တွက်ချက်မှုအပိုင်းအစများ၏ DNA အရွယ်အစားသည် DNA ထည့်သွင်းမှုပမာဏနှင့်အနီးကပ်ဆက်စပ်နေသည်။ အကွဲကွဲအပြားပြားမဆက်ဆံမီတုံ့ပြန်မှုစနစ်တွင် DNA ၏အတိအကျပမာဏကိုဆုံးဖြတ်ရန် Qubit, Picogreen နှင့်အခြားနည်းလမ်းများ သုံး၍ DNA ၏တိကျသောပမာဏသည်တိကျသည်။

 d) တုံ့ပြန်မှုစနစ်ပြင်ဆင်မှုသည်ညွှန်ကြားချက်ကိုမလိုက်နာပါကအစိတ်စိတ်အမွှာမွှာတုံ့ပြန်မှုစနစ်ကိုပြင်ဆင်ခြင်းသည်ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်းတင်းကျပ်စွာဆောင်ရွက်ရမည်။ အကောင်းဆုံးအကျိုးသက်ရောက်မှုကိုသေချာစေရန်တုံ့ပြန်မှုအစိတ်အပိုင်းအားလုံးကိုရေခဲတွင်ထားသင့်ပြီးအအေးခံပြီးနောက်တုံ့ပြန်မှုစနစ်ပြင်ဆင်မှုကိုလုပ်ဆောင်သင့်သည်။ ပြင်ဆင်မှုပြီးစီးပါကနှိုက်နှိုက်ချွတ်ချွတ်ရောမွှေပေးပါ။ ရေငုပ်မနေပါနဲ့။

၁။ မမှန်ကန်သောရောနှောနည်း (လေလှိုင်း၊ ကြမ်းတမ်းသောလှိုင်းများ၊ စသည်) သည်စာကြည့်တိုက်၏အပိုင်းအစများ (ပုံတွင်ပြထားသည့်အတိုင်း) ပုံမှန်မဟုတ်သောဖြန့်ဖြူးခြင်းကိုဖြစ်စေသည်၊ ထို့ကြောင့်စာကြည့်တိုက်၏အရည်အသွေးကိုထိခိုက်စေသည်။ ထို့ကြောင့် Fragmentation Mix တုံ့ပြန်မှုကိုပြင်ဆင်သောအခါရောမွှေရန်အပေါ်နှင့်အောက်သို့ညင်ညင်သာသာပွတ်ပေးပါ (သို့) ပွတ်သပ်ပြီးရောစပ်ရန်လက်ချောင်းထိပ်ကိုသုံးပါ။ ရေစီးနှင့်မရောရန်သတိပြုပါ။

၂။ သန့်ရှင်းစင်ကြယ်မှုမြင့်မားသော DNA ကိုစာကြည့်တိုက်ဆောက်လုပ်ရေးအတွက်သုံးရမည်

DNA ကောင်းသော DNA ခိုင်မာမှု၊ electrophoresis band သည်အမြီးမပါဘဲ ၃၀ kb ကျော်ရှိသည်

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

၃။ DNA ထည့်သွင်းမှုပမာဏတိကျရမည်။ Nanodrop ထက် DNA ကိုတွက်ချက်ရန် Qubit နှင့် PicoGreen နည်းလမ်းများကိုသုံးရန်အကြံပြုသည်။

၄။ DNA solution တွင် EDTA ပါဝင်မှုသည် EDTA သည်အကွဲကွဲအပြားပြားတုံ့ပြန်မှုအပေါ်အလွန်သြဇာရှိသည်ဟုဆုံးဖြတ်ရမည်။ EDTA ၏အကြောင်းအရာသည်မြင့်မားပါကနောက်ဆက်တွဲစစ်ဆေးမှုမတိုင်မီ DNA သန့်စင်ခြင်းကိုလုပ်ဆောင်ရန်လိုအပ်သည်။

၅။ အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်စေသောတုံ့ပြန်မှုကိုရေခဲတွင်ပြင်ဆင်ရမည်။ အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်စဉ်သည်တုံ့ပြန်မှုအပူချိန်နှင့်အချိန် (အထူးသဖြင့်မြှင့်တင်စက်ထည့်ပြီးနောက်) ကိုထိခိုက်လွယ်သည်။ တုံ့ပြန်မှုအချိန်တိကျသေချာစေရန် ကျေးဇူးပြု၍ ရေခဲပေါ်တွင်တုံ့ပြန်မှုစနစ်ကိုပြင်ဆင်ပါ။

၆။ အကွဲကွဲအပြားပြားတုံ့ပြန်မှုအချိန်သည်တိကျရမည်။ အကွဲကွဲအပြားပြားခြေလှမ်း၏တုံ့ပြန်မှုသည်အပိုင်းအစထုတ်ကုန်များ၏အရွယ်အစားကိုတိုက်ရိုက်ထိခိုက်လိမ့်မည်၊ ထို့ကြောင့်စာကြည့်တိုက်ရှိ DNA အပိုင်းအစများဖြန့်ဖြူးမှုကိုထိခိုက်စေသည်။

၁။ ဤကိရိယာအတွက်နမူနာအမျိုးအစားကားအဘယ်နည်း။

ဤကိရိယာ၏သက်ဆိုင်သောနမူနာအမျိုးအစားသည်စုစုပေါင်း RNA (သို့) ကောင်းမွန်သော RNA သမာဓိနှင့်သန့်စင်သော mRNA ဖြစ်နိုင်သည်။ စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရန်စုစုပေါင်း RNA ကိုသုံးလျှင် rRNA ကိုအရင်ဖယ်ရှားရန် rRNA depletion kit (Cat#4992363/4992364/4992391) ကိုသုံးရန်အကြံပြုသည်။

၂။ FFPE နမူနာများကိုဤကိရိယာဖြင့်စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရန်အသုံးပြုနိုင်သလား။

FFPE နမူနာများတွင် mRNA သည်ဆွေမျိုးသားချင်းသမာဓိအားနည်းမှုနှင့်အတူအတိုင်းအတာတစ်ခုထိကျဆင်းလိမ့်မည်။ စာကြည့်တိုက်ဆောက်လုပ်ရေးအတွက်ဤကိရိယာကိုသုံးသောအခါအကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်စေရန်အချိန်ဖြုန်းရန် (အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်အောင်အချိန်တို (သို့) အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်အောင်မလုပ်ဆောင်ပါ) ။

၃။ ကုန်ပစ္စည်းလက်စွဲတွင်ဖော်ပြထားသောအရွယ်အစားရွေးချယ်ရေးအဆင့်ကိုအသုံးပြုခြင်း၊ ထည့်သွင်းထားသောအပိုင်းသည်အနည်းငယ်သွေဖည်သွားစေခြင်းငှါအဘယ်အရာဖြစ်စေသနည်း။

ဤထုတ်ကုန်လက်စွဲ၌အရွယ်အစားရွေးချယ်ခြင်းအဆင့်နှင့်အညီအရွယ်အစားရွေးချယ်ခြင်းကိုတင်းကျပ်စွာဆောင်ရွက်ရမည်။ သွေဖည်မှုရှိလျှင်အကြောင်းပြချက်မှာသံလိုက်ပုတီးများသည်အခန်းအပူချိန်နှင့်မျှတမှုမရှိခြင်း (သို့) အပြည့်အဝမရောခြင်း၊ pipette မတိကျခြင်း (သို့) အရည်သည်အစွန်အဖျား၌ကျန်နေခြင်းဖြစ်နိုင်သည်။ စမ်းသပ်မှုအတွက်စုပ်ယူမှုနည်းသောအကြံပေးချက်များကိုသုံးရန်အကြံပြုသည်။

၄။ စာကြည့်တိုက်တည်ဆောက်ရာတွင် adapter များရွေးချယ်ခြင်း

စာကြည့်တိုက်ဆောက်လုပ်ရေးကိရိယာတွင် adapter reagent မပါ ၀ င်ပါ၊ ဤ kit ကို TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) နှင့်တွဲသုံးရန်အကြံပြုသည်။

၅။ စာကြည့်တိုက်၏ QC

စာကြည့်တိုက်အရေအတွက်ထောက်လှမ်းခြင်း: စာကြည့်တိုက်၏အစုလိုက်အပြုံလိုက်အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့်အံသွားအာရုံစူးစိုက်မှုကိုဆုံးဖြတ်ရန်သုံးသည်။ ထုတ်ကုန်သည်လက်စွဲစာအုပ်နှင့်အညီတင်းကျပ်စွာလုပ်ဆောင်သည်။ စာကြည့်တိုက်၏အာရုံစူးစိုက်မှုသည်ယေဘူယျအားဖြင့် NGS အစီအစဉ်၏လိုအပ်ချက်များနှင့်ကိုက်ညီလိမ့်မည်။ စာကြည့်တိုက်ဖြန့်ဖြူးမှုအပိုင်းကိုရှာဖွေခြင်း၊ စာကြည့်တိုက်ဖြန့်ဖြူးခြင်းအပိုင်းကိုရှာဖွေရန် Agilent 2100 Bioanalyzer ကိုသုံးပါ။

6. အသံချဲ့စက်ဝန်းနံပါတ်ရွေးချယ်ခြင်း

ညွှန်ကြားချက်များအရ PCR စက်ဝန်းအရေအတွက်သည် ၆-၁၂ ဖြစ်ပြီးနမူနာထည့်သွင်းမှုအရလိုအပ်သော PCR စက်ဝန်းအရေအတွက်ကိုရွေးချယ်သင့်သည်။ အထွက်နှုန်းမြင့်စာကြည့်တိုက်များတွင် Agilent 2100 Bioanalyzer အားရှာဖွေခြင်း၌ပစ်မှတ်အကွာအဝေးထက်အနည်းငယ်ပိုကြီးသောအားဖြင့်၎င်းသည်ကွဲပြားသောဒီဂရီများတွင်ဖြစ်ပေါ်သည်၊ သို့မဟုတ် QPCR ၏တွေ့ရှိမှုသည် qPCR ထက်နိမ့်သည်။ အသံချဲ့စက်အသံပျော့သည်ပုံမှန်ဖြစ်စဉ်တစ်ခုဖြစ်ပြီးစာကြည့်တိုက်အစီအစဉ်များနှင့်နောက်ဆက်တွဲအချက်အလက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကိုမထိခိုက်ပါ။

၇။ Agilent 2100 Bioanalyzer ၏ထောက်လှမ်းမှုပရိုဖိုင်းတွင်တွေ့ရပါသည်

Agilent 2100 Bioanalyzer ထောက်လှမ်းမှု၌ spikes များ၏ပုံပန်းသဏ္ဌာန်သည်မညီညာသောအကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်ခြင်းကြောင့်အချို့အရွယ်အစား၌အပိုင်းအစများပိုများလာပြီး၎င်းသည် PCR ကြွယ်ဝမှုပြီးနောက်ပိုမိုသိသာထင်ရှားလာလိမ့်မည်။ ဤကိစ္စတွင်၊ အရွယ်အစားရွေးချယ်ခြင်းကိုမလုပ်ဆောင်ရန်အကြံပြုသည်၊ ဆိုလိုသည်မှာအပိုင်းအစဖြန့်ဝေမှုသည်သေးငယ်ပြီးစုစည်းပြီးတစ်သားတည်းဖြစ်တည်ခြင်းကိုတိုးတက်စေနိုင်သည်။